把目的基因連接到質粒上構建重組質粒時該如何選擇限制性內切酶?引物如何設計？有許多方法，其中列出了一種或兩種：1。不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要刪除不同的粘性端和連接平端。有兩種方

把目的基因連接到質粒上構建重組質粒時該如何選擇限制性內切酶?引物如何設計？

有許多方法，其中列出了一種或兩種：

1。

不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要刪除不同的粘性端和連接平端。

有兩種方法可以將粘性端變?yōu)槠蕉耍篕lenow酶或S1核酸酶。

為了減少載體自連接，堿性磷酸酶可用于治療載體。

最后，將載體與目的基因連接，構建重組質粒。

[2.

設計引物，用其自身的限制性位點擴增目標基因。直接改變目的基因的限制性位點，用與載體相同的限制性內切酶對目的基因進行酶切，切出相同的粘端。

目標基因與載體直接連接。

怎樣構建質粒？

1. PCR擴增目的基因片段，需要設計引物，選擇同源序列，根據(jù)質粒載體和基因序列選擇限制性位點，純化PCR產(chǎn)物。2根據(jù)引物設計的限制性位點對PCR產(chǎn)物和質粒載體進行酶切，酶切產(chǎn)物應回收利用。三。PCR產(chǎn)物與質粒載體通過連接酶連接。4將連接產(chǎn)物轉化到受體菌（通常為dh5a）中，包被培養(yǎng)過夜。如果T載體上沒有限制性位點，則應重新設計具有限制性位點的引物。PCR擴增后，將T載體酶切后與表達載體連接。如果T載體上有必要的限制性位點，則直接限制后可恢復目的片段并連接到表達載體上。

怎樣設計引物克隆已經(jīng)構建好的t載體基因來構建表達載體？

如果需要擴增特定的基因片段并將其插入載體中構建質粒，則應根據(jù)載體上多克隆位點的限制性位點在目標基因片段的上下游設計一個序列，并將載體上的限制性位點引入載體中設計的順序。

此時，設計用于完成PCR擴增并在目標序列的上游和下游引入限制性位點的兩個序列稱為質粒構建引物。這樣，擴增得到的目的片段兩端就有酶切位點。酶切后與載體連接，載體經(jīng)酶切后形成環(huán)，完成質粒的構建。