做RT-PCR設計引物時，找引物序列有哪些好方法？引物可以由一些軟件設計，如primer 5，但需要注意一些細節(jié)。例如，1。引物應設計在模板cDNA的保守區(qū)。DNA序列的保守區(qū)是通過比較物種間的相似序

做RT-PCR設計引物時，找引物序列有哪些好方法？

引物可以由一些軟件設計，如primer 5，但需要注意一些細節(jié)。例如，1。引物應設計在模板cDNA的保守區(qū)。DNA序列的保守區(qū)是通過比較物種間的相似序列來確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（如dnaman）比對，每個基因的同一序列為該基因的保守區(qū)。2引物的長度一般在15到30堿基之間。引物長度一般為18～27bp，但不宜超過38，因為延伸溫度大于74℃，不適合taqdna聚合酶反應。三。引物的GC含量在40%～60%之間，TM值應接近72℃。GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不宜相差太大。另外，上下游引物的TM值（熔化溫度）是寡核苷酸的斷鏈溫度，即50%雙鏈寡核苷酸在一定鹽濃度下的溫度。有效啟動溫度一般比TM值高5～10℃。按公式TM=4（gc）2（at）估算引物TM值時，有效引物TM值為55～80℃，最佳復性條件下，有效引物TM值應接近72℃。