做RT-PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)，找引物序列有哪些好方法？引物可以通過(guò)一些軟件設(shè)計(jì)，比如primer 5 ，但是還需要注意一些細(xì)節(jié)問(wèn)題。比如1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。 DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)

做RT-PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)，找引物序列有哪些好方法？

引物可以通過(guò)一些軟件設(shè)計(jì)，比如primer 5 ，但是還需要注意一些細(xì)節(jié)問(wèn)題。比如1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。 DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。 引物長(zhǎng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G C） 2（A T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

怎樣根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)引物？

mRNA序列和cDNA序列基本一致，只是T、U的對(duì)應(yīng)。引物設(shè)計(jì)是根據(jù)cDNA的兩端序列，上游引物與cDNA的5‘端相同，下游引物與cDNA的3’反向互補(bǔ)序列相同，即與cDNA的互補(bǔ)序列的5‘端相同。cDNA的序列你在pubmed的網(wǎng)站可以找到（CDs那一項(xiàng)）。具體幾個(gè)堿基，一般是15~18個(gè)就差不多了，盡量保證上下游引物的GC含量一致。這樣PCR的時(shí)候，引物結(jié)合的效率是一致的，PCR成功的幾率更高。另外，如果要做克隆質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然需要加入酶切序列啦！酶切位點(diǎn)的選擇也有幾點(diǎn)要注意的，你需要的話我再詳細(xì)說(shuō)?。?/p>

如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)？

如果這一對(duì)通用引物沒(méi)有信號(hào)，說(shuō)明你這個(gè)菌在這兩個(gè)位置有snp，導(dǎo)致擴(kuò)增不出來(lái)。幾個(gè)方法可以參考一下。

1:你們大概知道這個(gè)菌的種屬，那么就去ncbi上找近緣物種的16s序列，做序列比對(duì)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)，測(cè)序。

2:你們完全不知道種屬，上網(wǎng)多找?guī)讓?duì)通用引物，最好是擴(kuò)增V3V4區(qū)或者V4區(qū)的，擴(kuò)增出部分再去測(cè)序比對(duì)，一般能確認(rèn)屬，再按照1的方法做。

3:在方法2能擴(kuò)增部分序列但是設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物擴(kuò)增失敗的情況下，利用得到的部分序列做race。

4:前面全部失敗，提取DNA做2代測(cè)序，直接測(cè)基因組（如果覺(jué)得成本太高，可以少測(cè)點(diǎn)數(shù)據(jù)量，夠比較就可以了）。