PCR引物設(shè)計時有哪些注意事項？引物設(shè)計參數(shù)：a引物長度一般在20bp左右，上下游引物堿基長度不要相差超過4個堿基。b引物退火溫度一般在58度，不同軟件TM使用不同的算法，primer3，primer

PCR引物設(shè)計時有哪些注意事項？

引物設(shè)計參數(shù)：a引物長度一般在20bp左右，上下游引物堿基長度不要相差超過4個堿基。b引物退火溫度一般在58度，不同軟件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以設(shè)置在55-58度，beacondesign可以設(shè)置在65左右。cGC含量一般沒什么特殊要求，40-60最好，如果不好設(shè)計，30-80也是可以的。d產(chǎn)物長度在100-150，80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區(qū)分，超過200bp可能會影響PCR擴增效率。e軟件給出的引物不能有發(fā)卡結(jié)構(gòu)和超過3-4個堿基的匹配，特別是3`端不能有堿基匹配，那樣更容易形成二聚體。f引物設(shè)計好以后，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

pcr引物設(shè)計詳細步驟？

引物設(shè)計的詳細步驟

一、引物設(shè)計step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的rigin中，Cpy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。 2、

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做RT-PCR設(shè)計引物時，找引物序列有哪些好方法？

引物可以通過一些軟件設(shè)計，比如primer 5 ，但是還需要注意一些細節(jié)問題。比如1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在15~30堿基之間。 引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G C） 2（A T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。