RNA-Seq測序后，經(jīng)常用QPCR來驗(yàn)證結(jié)果。因?yàn)镽NA-Seq測序數(shù)據(jù)得到的結(jié)果作為定量參考，參數(shù)的變化也會造成不同的結(jié)果。所以需要QCPR驗(yàn)證，表達(dá)水平的結(jié)果最終以實(shí)時(shí)定量qPCR為準(zhǔn)。一般需要

RNA-Seq測序后，經(jīng)常用QPCR來驗(yàn)證結(jié)果。

因?yàn)镽NA-Seq測序數(shù)據(jù)得到的結(jié)果作為定量參考，參數(shù)的變化也會造成不同的結(jié)果。所以需要QCPR驗(yàn)證，表達(dá)水平的結(jié)果最終以實(shí)時(shí)定量qPCR為準(zhǔn)。一般需要驗(yàn)證的基因數(shù)量在20個左右。在驗(yàn)證過程中，RNA-Seq測序和QPCR的結(jié)果往往不一致，這是正常現(xiàn)象。原因可以在我們之前分享的文章中找到(戳這里)。事實(shí)上，我們看到的很多SCI都有驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，文章里的結(jié)果其實(shí)很不錯！很多同學(xué)心里比較著急。為什么我的成績沒有達(dá)到預(yù)期？為什么我的成績跌得這么慘？！其實(shí)也許是作者驗(yàn)證了幾個基因，選出了10個效果不錯的基因。其他驗(yàn)證結(jié)果不佳、與預(yù)期結(jié)果不符或自身無法解釋清楚的基因，建議不要在文章中呈現(xiàn)。所以通常是幾個，比如10個，在文章中闡述。驗(yàn)證多少基因，要看要發(fā)表的雜志的水平和要求。大概驗(yàn)證20篇一般文章就夠了。在RNA-Seq實(shí)驗(yàn)中，如果重復(fù)樣本之間的相關(guān)系數(shù)很高，那么只需要驗(yàn)證你關(guān)心的基因。下面我們列舉一些文獻(xiàn)中QCPR驗(yàn)證的RNA-Seq截圖，包括Mrna、miRNA、Lnc-RNA。不難看出，很多基因QCPR的結(jié)果與

BSR序列是基于貝葉斯方法來計(jì)算SNP標(biāo)記和目標(biāo)基因之間的重組概率。該方法適用于資金較少、群體數(shù)據(jù)較好的實(shí)驗(yàn)室定位目的基因。由于使用了混合RNA測序，可以大大降低成本，同時(shí)可以獲得更好的定位效果。此外，還可以分析基因表達(dá)。

材料的混合會導(dǎo)致差異基因的減少。如果不同表型的親本之間候選基因的差異是由表達(dá)差異引起的，

非編碼RNA是指能從DNA轉(zhuǎn)錄，但不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。非編碼RNA序列包括核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、microRNA RNA(長非編碼RNA、胞外RNA (exRNA)等多種類型[1]。

(來源:)

那么如何確定一個RNA分子是非編碼RNA呢？

(1)如果已知該RNA分子的id(基因ID或轉(zhuǎn)錄ID(Transc))。Rapid)，可以直接在基因組注釋文件中為它查找注釋，從而判斷它是否屬于非編碼RNA。

基因組注釋是利用生物信息學(xué)的方法和工具對基因組中所有基因的生物功能進(jìn)行高通量注釋[2]?；蚪M注釋文件可以從能夠檢索基因組學(xué)信息的基因組學(xué)項(xiàng)目網(wǎng)站下載，如GENCODE()、ENSEMBL()等。在 "。gtf "or "。gff "從上述網(wǎng)站下載，如果要搜索的RNA分子的基因ID對應(yīng)的注釋文件標(biāo)有 "線粒體trna和rrna，lincrna "，它是非編碼RNA。

(2)如果該RNA分子的基因ID或轉(zhuǎn)錄本ID未知，但其序列信息已知，則可通過比較方法如Blast將該RNA序列與已知基因組的序列進(jìn)行比較，并可找到該序列在基因組中的位置:

如果比對結(jié)果落在基因組的注釋位置，則可以直接獲取該序列的基因ID和基因組文件的注釋信息，步驟同(1)。

如果比較結(jié)果落在注釋的位置，則可以通過計(jì)算生物學(xué)軟件計(jì)算出該序列的翻譯能力。如果翻譯能力小，說明RNA分子幾乎不可能翻譯成蛋白質(zhì)，符合非編碼RNA的定義?？梢杂?jì)算序列非編碼能力的軟件有COME()、CPC()等。

(3)如果這個RNA分子的序列信息未知，可以通過實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行擴(kuò)增測序，得到它的序列信息，然后步驟同(2)。

參考

[1] Mattick，J.S .和I.V. Makunin，非編碼RNA。哼莫熱內(nèi)特，2006年。15規(guī)格編號第R17-29頁。

[2]基因組筆記/7252093？弗拉丁